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最难克隆动物在中国诞生,未来私人定制宠物要成现实?
发布时间:2017年7月31日    查看次数:607    来源:北京科技报

狗是与人类最亲近的动物,也是最难克隆的动物。世界首例基因编辑克隆犬已在中国诞生。在不久的未来,定制宠物或将成为现实。

说起克隆动物,你首先想到的一定是1996年诞生于英国的克隆羊多莉。

▲ 图片来自网络

多莉的诞生不仅轰动了生物学界,也吸引了全世界的目光。从此,克隆,这个生僻的专业术语也开始变得广为人知。其后,克隆猴、克隆牛纷纷问世。而犬被认为是最难进行体细胞克隆的动物之一。

不过,中国科学家已经克服了这个困难。528日,我国自主培育首例体细胞克隆犬,也是世界首例基因编辑克隆犬——龙龙在北京西北郊的昌平科技园区出生。这不仅标志中国成为全球第二个独立掌握克隆犬技术的国家,也意味着宠物狗的商业克隆技术在我国正走向现实。

一看到又有人来参观自己,比格犬龙龙和它的代孕母亲都兴奋起来,在笼子又蹦又跳,实验人员将笼子打开,一个半月大的龙龙欢天喜地地跑出来玩,没过一会儿,它就跟所有在场的人都熟络起来,扑脚、要抱抱。如果不说,一定不知道,这其实是一只基因编辑克隆犬,它的降生,也为中国克隆技术开启了新的篇章。

 

▲世界首例基因编辑的克隆犬——龙龙(摄影/白竟楠)

 

▲“英雄的母亲”——龙龙的代孕妈妈(摄影/白竟楠)

“龙龙”的出生,标志着我国成为继韩国之后第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。这项研究由中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员带领北京希诺谷生物科技有限公司的科研团队共同完成。


全球首条克隆犬由韩国科学家黄禹锡创造


2005年424日,韩国秀岩生命研究院黄禹锡(Hwang Woo-suk)研究小组捧出了世界上第一只克隆犬,它被命名为Snuppy,系阿富汗猎犬(公犬)。

 

200583日,黄禹锡领导的研究小组在首尔将一条9周大的阿富汗猎犬“斯纳皮”介绍给公众,并称它是世界上第一条克隆狗。(图片来自网络)

2014年4月,秀岩研究所又诞生一条克隆犬,这条克隆犬的母本是英国西伦敦瑞贝卡?史密斯(Rebecca Smith)养的达克斯猎狗维尼,科学家利用她12岁的宠物维尼的皮肤细胞克隆了“迷你维尼”。

虽然黄禹锡后来由于学术不端行为声名狼藉,但学界对于他的克隆犬研究成就却未有质疑。黄禹锡研究小组表示,已经创造了几百个克隆动物,其中包括在美国的几十只。

在“龙龙”出生之前,世界上除了韩国还没有国家能成功通过自主研发技术克隆犬。

 

创造“龙龙”使用的是中国原创克隆技术



中国首例体细胞克隆犬——龙龙出生体重200克(图片来自网络)

中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员赖良学表示,韩国克隆犬在开发成功之后也发表了论文,但是许多技术环节描述不清晰,按照论文的步骤无法重复实验作出克隆犬。

所以,此次“龙龙”的诞生是中国原创的克隆技术。“都是克隆技术,从技术路线上来说是差不多的,但是具体的技术细节由于韩国的保密措施我们无从知晓,此次成果花费了很多时间和投入才打通了克隆犬的技术路线。我从事克隆动物研究多年,也做过克隆猪。但是狗和其它动物不同,用克隆其它动物的技术参数也是做不出来的。可以说,克隆犬龙龙的实验步骤没有最关键,而是全部都很关键。”赖良学说。

 

▲龙龙对于喜欢宠物犬的记者一点也不认生。


狗是最难克隆的一种动物


1996年克隆羊“多利”在英国诞生以后,有越来越多的国家相继掌握了动物克隆技术,全国人大代表、中科院动物研究所研究员张钟宁曾经说过:中国克隆技术早在20世纪6070年代就已开始,目前(2005年),我国一次性就能够克隆14头牛,这标志着中国已完全掌握了世界一流的体细胞克隆牛技术,克隆人与克隆动物的技术没有特别本质的区别,都是基于胚胎克隆技术。因此,克隆人在技术层面上都是没有问题的。

但是,克隆犬这件事儿却一直困扰着科学家。这是因为狗狗独特的生殖生理特点给科学家们出了难题。

据北京希诺谷生物科技有限公司研究人员冯冲介绍,克隆犬主要分为以下几步:

首先,要先从需被克隆的犬身上取皮肤组织分离细胞;

其次,要从一条母犬身上采集未受精的卵母细胞;

再者,将犬的皮肤细胞放入除去细胞核的母犬卵母细胞中,形成融合胚;

另外,要将融合胚在实验室培育到一定时期;最后,再将胚胎植入代孕母犬的子宫内,经过正常的妊娠,克隆犬成功诞生。

目前全世界有11种已经被克隆的动物,包括犬,但是只有犬的卵母细胞体外成熟效率最低,这也给克隆造成了难度。

 

▲手术和保育负责人陈奔驰和龙龙(摄影/白竟楠)

体外成熟有两个重点,一是把卵母细胞养活,二是要让卵子有受精能力。但是犬的卵母细胞质量很差,十分脆弱,对外部环境敏感,在核移植的时候,很有可能因为操作不当的刺激而死亡,而且对外部环境的变化耐受力很差,比如温度和湿度的一点变化就可能对它造成刺激。

卵母细胞的发育是由原始的生殖细胞发育成为卵原细胞,经过有丝分裂发育成初级卵母细胞。之后初级卵母细胞经过生发泡破裂和减数分裂,发育成成熟的卵子。别的动物比如猪牛羊,初级卵母细胞就可以取出后在体外培养成为成熟的卵子,而且只需要去屠宰场获得已经被屠宰的牲畜的卵巢,从卵巢的卵泡里取出初级卵母细胞培养就可以了。

而由于犬的卵母细胞十分脆弱,必须要在体内发育成熟,到第二次减数分裂中期(MⅡ)时才能通过手术法在输卵管内冲卵,获得成熟的卵子。犬的生殖周期期长达几个月,在发情期间必须对其激素水平多次测定,才能判断卵母细胞何时进入成熟阶段。

一般的动物可以通过激素来控制卵母细胞成熟的时间点,但犬无法用激素控制,只能等卵母细胞在卵巢里自然排出至输卵管里,经过几天时间自然发育成熟,且要选择成熟状态最好的时候取出,但这一最佳品质状态只能维持几个小时,获得成熟且质量好的卵细胞的窗口期非常短。因此必须准确判断时间,才能获得处于理想状态的卵子用于克隆胚胎的制备。

 

▲卵母细胞犬的卵母细胞在输卵管成熟,且质量较差,增加了克隆难度(图片来自网络)

赖良学说:“犬卵母细胞卵黄内含有大量脂肪,使卵细胞在镜下呈现黑色,克隆时需要将供体的卵细胞核移去除,而不透明的卵细胞给去核带来了难度。克隆犬的最后一步是将移植到代孕犬的子宫中。这需要代孕犬的发情周期和与核移植胚所处的发育阶段同步,由于狗的发情期时间很长,所以代孕犬的子宫环境是否适宜克隆胚胎生长发育难以保证,这造成着床率较低,克隆狗的效率就低了。”

希诺谷生物科技有限公司常务副总经理赵建平说,每一个技术环节都很关键,各个环节的难度叠加到一起,更让克隆狗成为一种“难产”的被克隆动物。未来,随着技术的逐步优化,制作克隆犬所使用的供体和受体数量会下降。


“龙龙”的克隆原型是世界首例动脉粥样硬化模型犬


“龙龙”并不是一只简简单单复制别人家狗的克隆犬,它是世界首例通过CRISPR/Cas9技术实现的动脉粥样硬化疾病模型犬的克隆犬,这只疾病模型犬在201612月诞生,被命名为“苹果”。

 

▲世界首例通过CRISPR/Cas9技术实现的动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”

“苹果”通过CRISPR/Cas9技术敲除载脂蛋白EAPOE)基因,这个基因不表达之后,使犬血液中的脂类代谢发生紊乱,天生患有高脂血症,最终产生动脉粥样硬化的疾病表型。该项成果的取得为研究人类动脉粥样硬化的发病机理及新药研发提供了理想的大动物模型,这是继我国2015年取得狗基因打靶技术突破之后,首次将其应用于人类遗传疾病狗模型的培育。

APOE是血浆脂蛋白的重要组成部分,对脂质在细胞内代谢和分布有重要调节作用,特别是与机体总胆固醇的代谢密切相关。APOE的低表达或缺失将导致血脂含量的升高,从而诱导动脉粥样硬化疾病。

目前,动脉粥样硬化疾病的发病机制及新药物研发尚无合适的犬疾病模型,多利用小鼠为模型进行研究。“苹果”的诞生为动脉粥样硬化疾病的发病机制及新药物研发可以使用大动物疾病模型提供了可能,也就为药物研发提供了更有效的动物实验证据。

冯冲表示,几乎所有的哺乳动物基因测序之后的基因相似度都大于80%,所以用遗传距离来表示物种之间的遗传形状形似度更为准确,也就是从多少年前开始分离物种的。人与狗的遗传距离比人与老鼠的遗传距离更近,一些药物在做完犬的药物试验之后,就可以进入一期临床实验了。

而且,犬在遗传性疾病方面与人类极为相似,约有癌症、心脏病、聋哑、失明和免疫性神经系统疾病等360多种遗传疾病,发病症状与人类临床症状十分相似。此外,犬在新陈代谢、生理学、解剖构造等方面都与人有许多相似之处,这些优势是小鼠及其它模式动物不可替代的,是研究人类许多疾病理想的模式动物。

其实,比格犬作为实验动物已经有几十年的时间,作为一种较常用的模式生物,科研人员对于它的了解难道不足以支撑让克隆犬和疾病模型犬更早几年“出生”吗?

对此,赖良学表示,人类主要对狗的行为研究和认知研究的比较透彻,代谢和生理指标也掌握的较为全面,但是对狗的生殖研究尚不全面,对狗的胚胎体外培养研究等方面都很不成熟,虽然科研人员一直在研究,但是没有得出确切的成果。


 “基因编辑+克隆”实现定制生物


在人们传统的观念中,克隆就是复制,没有更多的技术意义。其实不然,在当今基因编辑技术火爆的时代,克隆技术能与基因编辑技术结合而发挥更大的作用。

疾病模型动物的生产虽然在犬身上很难实现,以至于作为模式生物多年,狗狗们还是“最初的样子”,但是通过基因编辑制作疾病模型生物已经在小鼠身上广泛应用,制作技术成熟。不同的遗传性疾病可能由不同的基因突变造成,可能是基因丢失,也可能是多余基因的插入,也可能是点突变。

 

▲龙龙出生地“产房”——实验室(摄影/白竟楠)

因此,针对不同疾病就要采取基因敲除、基因敲入和点突变等不同编辑模式才能培育出想要的动物模型。在小鼠,通过受精卵注射通过可以高效的培育出基因敲除模型,但基因敲入成功率只有20%,点突变就更难以实现。在犬身上用受精卵注射技术途径可以实现基因敲除,2015年我国诞生了第一对基因敲除犬。但是要想做基因敲入难度就大了,这时就需要用到克隆技术,当两种技术结合在一起的时候,就可以实现更多的功能。

犬的作用不仅停止在实验动物模型水平,它也具备许多辅助人类工作的功能,也就是工作犬。2015年,世界第一只基因敲除犬被选取肌肉生长抑制素基因作为第一个敲除目标基因,该基因对骨骼肌生长具有抑制作用,被敲除后,肌肉生长发育能力增强,只需要获得一对相同基因敲除犬,他们的后代就都会缺少同样的基因,就可以被培养出一支品系,具有发达肌肉的犬更适用于用作警犬。同时,为定制帕金森症、渐冻人症等疾病研究提供了更合适的疾病模型。

同时,克隆犬还有较为广阔的“情感克隆”需求。2016年,一对英国夫妇养了多年的爱犬死亡,为了让它“复活”,这对英国夫妇支付了十万美元去韩国秀岩研究所克隆了一只一模一样的狗,这也是韩国秀岩研究所第一次在已经死亡八天的犬身上取得了样本。而这样的克隆需求并非个案。

 

▲英国约克郡一对夫妇劳拉和理查德花了8万英镑(约合人民币68万)克隆了2只小狗,原因是思念自己已过世的爱犬。图为理查德劳拉夫妇和他们的两只克隆犬,最左侧和最右侧两只狗是代孕妈妈。(图片来自网络)


法律并未禁止克隆动物


对于普通大众来说,克隆好像并不是为了科研,在法律上也好像不符合法律规范。事实上,除了克隆人,克隆动物如果用作科学研究,在法律上并无禁止。

克隆人以及涉及人体器官的克隆是被严格禁止和限制的。中国在20022月联合国举行的关于拟定《反对生殖性克隆人国际公约》会议上,中国代表表明了我国立场:反对克隆人、不赞成、不允许、不支持、不接受任何克隆人实验,但主张对治疗性和生殖性克隆加以区别。

欧盟委员会在200111月发表声明指出,将克隆技术用于克隆人类与欧洲公民的伦理道德观背相而弛,因此欧盟反对克隆人,并且现在和将来都不会对克隆人研究提供任何资助。2002410日,美国总统布什曾在白宫发表讲话,敦促美国参议院通过对立法禁止所有形式的克隆人的实验。

而对于正常的科研需求,克隆动物是光明正大的,也是必须的。但是在科研单位开启动物实验前,必须遵循我国和地区实验动物操作规范,单位需取得实验动物许可证之后才能进行动物实验,并按照《实验动物管理条例》开展实验。我国尚无针对克隆动物的单独规定,克隆动物被列为实验动物中基因修饰动物中的一类。在实验开展前,需由各个单位的伦理委员会对实验环节和实验动物的使用进行评估,经伦理委员会通过才能进行实验。欧洲同样如此,根据欧洲科学基金会的调查,每个研究团体中都成立了伦理评估委员会。

希诺谷生物有限公司伦理委员会负责人由赵建平担任,他表示,为了获得成熟可用的犬卵母细胞,需要对实验犬做麻醉手术,用一支细细的针把成熟的卵细胞从输卵管里冲出来,腹部会有一个小创面,取完之后缝合、恢复就可以了,实验造成的创伤比普通的宠物绝育手术小很多。恢复健康的狗就可以送去领养,而且也不会影响寿命。“每项实验开始之前必须要充分考虑和保证动物福利”赵建平说。

在普通大众眼里,克隆动物好像寿命很短,对此,中国科学院院士周琪早已给出了解释:在出生的克隆动物中,的确会发现一些异常的生理表型,其中包括出生时体重过重、胎盘过大、围产期高死亡率、心肺功能不全、早衰等。

 

▲龙龙作为一只疾病模型犬的克隆犬,将为人类做出更大的贡献。(摄影/白竟楠)

但是令人感兴趣的是,这些异常的表型并不会遗传到克隆动物的子代中,也就是说,这种克隆动物的异常表型并不是基因组DNA遗传的因素导致的。研究者发现,在细胞移入卵母细胞后,会出现基因组重编程,在这个过程中,遗传组成不会改变,但是表观遗传——基因组中的染色体甲基化、组蛋白乙酰化与甲基化、染色质结构等都会发生变化。正是这些表观遗传修饰的原因,引起了基因表达水平的改变,从而导致了克隆动物可能出现一些异常的表型。

2008年1月,美国FDA正式宣布,来源于克隆猪、牛和羊的肉、奶产品是安全可靠的,完全可以放心地食用。虽然这并不能证明克隆动物作为食品一定是安全的、不受争议的,但至少克隆动物是被认可的,也是允许存在的。

龙龙作为一只疾病模型犬的克隆犬,随着它的长大,还会有更多科研成果从龙龙身上诞生。希望龙龙给我们带来更多的惊喜!
 

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